尹昌隆出身贫寒，年幼时常寄宿于城东慈恩梵宇。每日用纸罩住佛灯，端坐读书，至夜半时分。天一亮，又起床攻读，如此长年不懈。洪武二十九年（1396）乡试，拔得头名，解元。第二年又荣登榜眼，授翰林院编修，后改监察御史。
惠帝即位（1399)，每次退朝时，总要宴请朝臣。尹昌隆上疏劝谏说：“太祖高皇帝鸡鸣即起，天不亮就上朝，勤于政事，所以天下太平。陛下继承大位，应效法先帝，兢兢业业，而今，日上数刻，犹未临朝。群臣宿卫，疲于伺候，旷职废业，上下懈弛，播之天下，传之四裔，非社稷福也。”惠帝称赞尹昌隆敢于直言，命礼部将尹昌隆的奏疏“宣示天下，使知朕过。”不久，京师地震，尹昌隆又上疏，认为这是“奸臣-，阴盛阳衰，谪见于天，是以地震。”从而得罪了执政大臣，被贬为福宁知县。
燕王起“靖难”之师，兵临京城。尹昌隆建议惠帝罢兵，准许燕王入朝，甚至可以让出帝位。尹昌隆写道：“今事势日去，而北来章奏，每以周公辅成王为言，不若罢兵息战，许其入朝，彼既欲申大义于天下，不应，便相违戾，设或有蹉跌，便当让位，不失为藩王。若沉吟不断，祸至无日，进退失据，虽欲求为丹徒布衣，不可得矣。”惠帝不听。
尹昌隆的书生意气，并没有换来天下太平。燕王进京后，还是把他列为奸党，拉出要斩。尹昌隆大呼冤枉，高声道：“臣曾-劝让位，奏牍尚在。”燕王令人找出，读后很是感动，说：“火烧头，早从此言，南北生灵，受祸不若是酷，朕亦无此劳苦。”尹昌隆因此捡了一条性命。
永乐二年（1404)，成祖立世子为皇太子，遂升尹昌隆为左春坊左中允。成祖高兴地对尹昌隆说：“朕长子在北京，可往辅之”。太子也十分敬重尹昌隆。不久，改任他为礼部主事。
礼部尚书吕震为人刻薄好妒忌，他有个习惯，独自冥思苦想时，常爱用手指摸眉毛，此时，必定有阴谋诡计。每当此时，下属-都不敢向他请示汇报，尹昌隆新到任并不知此规矩，恰遇有急事要向吕震请示，吕震满面怒容，不予理睬。过一会儿，尹昌隆又去请示，吕震大怒，拂衣而起。尹昌隆只好退而请示太子，得到太子赞同后，立即执行。吕震知道后，更是怒不可遏，寻机诬告尹昌隆结党营私，蓄谋造反，将尹昌隆逮捕入狱，直到遇大赦才复官。不久，尹昌隆的父亲去世，他守孝回乡。期满，尹昌隆回朝拜见吕震，吕震表面好像很温和，可暗中又罗织罪名，再次把尹昌隆投进监狱，并抄没家产。数年后，谷王谋反事发，吕震见时机正好，便想置尹昌隆于死地，他密令自己的女儿练习尹昌隆的字体，伪造信件，诬告尹昌隆与谷王是同谋。尹昌隆有口难辩，被判处极刑，夷其家族。此冤案直到吕震死后，才得以昭雪。临刑前尹昌隆咬破手指，用血在衣衫上写下一首绝命诗：“吾今四十九年春，岂料奸权害此身。虎穴定为冤枉鬼，鸡窗空作读书人。妻儿那忍肝肠断，兄弟难忘骨肉亲。寄与家庭诸长者，吾今有屈屈难伸。”全诗悲怆凄切。后太子登基为仁宗皇帝。吕震病死，仁宗说：“是吕震杀了我的老师。”遂派人四处寻访到尹昌隆之子，赐给御马送回家乡，尹昌隆的冤案才得以昭雪。
不过尹昌隆死后，吕震的日子也没好过，也许是内心有愧，终不得释。据说在其病重期间，恍惚见尹昌隆坐守，吕震连连叩头惊呼：“尹相，尹相。”妻子将其唤醒，问他缘故，吕震满面惊恐说：“尹昌隆欲杀我。”言毕竟死。
尹昌隆为人耿直，在二十年的官宦生涯中，清廉自守。在任御史巡按福建时，--，平反冤狱，风纪肃然，颇有政绩。
著有《尹讷庵遗稿》八卷。